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    • 专利摘要:
    本發明提供一種可簡便且有效率地製造如預防由腦功能降低引起之症狀或疾病、進而顯示出改善效果之對醫藥品或食品之應用優異的更安全之化合物的方法。具體而言，本發明提供一種胜肽之製造方法，其特徵在於：其係包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽之製造方法，並且使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並自所獲得之發酵乳採集該胜肽。
    公开号:TW201311903A
    申请号:TW101122533
    申请日:2012-06-22
    公开日:2013-03-16
    发明作者:Naoto Uchida；Hiroaki Goto；Kazuhito Ohsawa；Kohji Ohki
    申请人:Calpis Co Ltd；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    利用乳酸菌發酵之酪蛋白衍生胜肽之製造方法
    本發明係關於一種利用乳酸菌發酵之酪蛋白衍生胜肽之製造方法。又，本發明係關於一種含有該胜肽之組合物或功能性食品之製造方法。
    由腦功能降低引起之症狀及疾病有抑鬱症、精神分裂症、譫妄症、癡呆症(腦血管性癡呆症、阿茲海默氏病等)等。隨著現代社會之高齡化，尤其是癡呆症患者增加逐漸成為嚴重之社會問題。癡呆症之症狀因人而異，但作為可見之共同症狀，可列舉：記憶障礙、定向力障礙、判斷力-思考力之降低等。於癡呆症中，多數患者為腦血管性癡呆症與阿茲海默氏病。例如，腦血管性癡呆由於大腦皮質或海馬區神經細胞因腦血流障礙而受到損傷，故而表現出癡呆、記憶障礙。因此，除了治療有可能產生腦血管障礙之高血壓、糖尿病、高膽固醇血症等基礎疾病以外，亦應用改善腦血流之藥物或保護腦神經細胞之藥物。另一方面，阿茲海默氏病雖然原因尚未明確闡明，但由於可見其患者之作為腦內之神經傳遞物質之乙醯膽鹼之水準降低，故而認為原因之一為膽鹼功能性神經之功能降低(例如參照非專利文獻1)。因此，於阿茲海默氏病中，以提高乙醯膽鹼之濃度而防止膽鹼功能性神經之功能降低為目的之治療方法逐漸成為主流。
    目前，作為阿茲海默氏病之治療藥物，例如市售有鹽酸多奈哌齊等乙醯膽鹼酯酶抑制劑。但是，鹽酸多奈哌齊等乙醯膽鹼酯酶抑制劑存在因具有肝臟毒性或較強之副作用，故而無法長期服用，又，價格昂貴之問題。
    又，作為關於胜肽表現出健忘改善效果之報告，例如報告有藉由側腦室內投予或經口投予XPLPR(X為L、I、M、F或W)300 mg/kg而顯示出對莨菪胺誘發健忘之改善效果，作為其機制之一，提示有利用腦內C3a受體而釋放乙醯膽鹼(專利文獻1)。認為莨菪胺作為毒蕈鹼受體拮抗劑而引起膽鹼功能性神經之功能降低，作為腦功能障礙誘發劑而發揮作用，故而用於阿茲海默氏病治療藥物開發時之模型動物製作。對於利用該莨菪胺作用之腦功能障礙之預防及/或改善作用，例如可藉由Y字迷宮試驗、八方向迷宮試驗、被動迴避試驗等行為藥理試驗而證實效果。又，藉由使用正常動物之相同之行為藥理試驗，可證實腦功能之改善及/或強化效果。但是，任一胜肽為了顯示出作用均需要進行大量之經口投予、或腹腔內投予、腦室內投予等投予，並未作為可經口攝取之物質而顯示出充分之效果。 [先前技術文獻] [專利文獻]
    [專利文獻1]日本專利第3898389號公報 [非專利文獻]
    [非專利文獻1]Science,217,408-414(1982)
    隨著高齡化社會之發展，越來越強烈期待開發出一種如預防由腦功能降低引起之症狀或疾病、進而顯示出改善效果之對醫藥品及食品之應用優異的更安全之化合物。又，亦謀求可簡便且有效率地製造此種化合物之方法。
    本發明者為了解決上述課題進行努力研究，結果發現由乳蛋白質酪蛋白衍生之胜肽具有腦功能改善作用。本發明者此次發現：藉由乳酸菌發酵，可簡便且有效率地製造該酪蛋白衍生胜肽。因此，獲得利用乳酸菌發酵而製造特定之酪蛋白衍生胜肽，又，可製造具有腦功能改善作用之胜肽及組合物之知識見解，從而完成本發明。
    即，本發明包含下述內容。
    [1]一種胜肽之製造方法，其特徵在於：其係包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽之製造方法，並且使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並自所獲得之發酵乳採集該胜肽。
    [2]如[1]之方法，其中乳酸菌係屬於選自由乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、小球菌屬、及魏斯氏菌屬所組成之群中之屬之至少1種細菌。
    [3]如[1]或[2]之方法，其中乳酸菌係選自由瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、嗜澱粉乳桿菌、加氏乳桿菌、副乾酪乳桿菌、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、洛德乳桿菌、捲曲乳桿菌、雞源乳桿菌、短乳桿菌、發酵乳桿菌、胚芽乳桿菌、及約氏乳桿菌所組成之群中之至少1種。
    [4]如[1]或[2]之方法，其中乳酸菌為嗜熱鏈球菌。
    [5]如[1]或[2]之方法，其中乳酸菌為瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)。
    [6]如[1]至[5]中任一項之方法，其係自開始發酵起3~96小時後採集胜肽。
    [7]一種含有包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽的組合物之製造方法，其特徵在於：其係使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並將所獲得之發酵乳或自其所採集之包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽製劑化。
    [8]一種組合物，其特徵在於：含有包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽。
    [9]一種發酵乳組合物，其特徵在於：其係使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵獲得，並且含有包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽。
    [10]如[9]之組合物，其含有0.1 μg/ml以上之上述胜肽。
    [11]一種飲食品，其調配有如[8]至[10]中任一項之組合物。
    [12]一種補充品，其調配有如[8]至[10]中任一項之組合物。
    [13]一種功能性飲食品之製造方法，其特徵在於：其係使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並將所獲得之發酵乳或自其所採集之包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽調配於飲食品中。
    [14]一種乳酸菌或其處理物之用途，其係為了生成包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽而使用至少1種。
    根據本發明，可提供一種酪蛋白衍生胜肽之製造方法。該酪蛋白衍生胜肽主要具有腦功能改善作用，且藉由本發明之製造方法可簡便且有效率地製造此種功能性胜肽。又，根據本發明，可提供一種含有該胜肽之組合物或功能性食品之製造方法。
    以下，詳細地說明本發明。
    本發明者發現具有如下胺基酸序列之酪蛋白衍生胜肽具有腦功能改善作用(參照下述實施例4~11)：Xaa-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Xaa(序列編號5)[式中，1位之Xaa不存在或者表示Ile或Asn-Ile，在19位之Xaa不存在或者表示Val-Met]。
    Xaa-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號6)[式中，1位之Xaa不存在或者表示Ser-Trp、或Leu-Gln-Ser-Trp]。
    作為包含序列編號5所示之胺基酸序列之胜肽，尤佳為包含序列編號1或2所示之胺基酸序列之胜肽：Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(序列編號2)。
    又，作為包含序列編號6所示之胺基酸序列之胜肽，尤佳為包含序列編號3、4或16所示之胺基酸序列之胜肽：Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號3)Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號4)Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號16)。
    本發明係關於一種藉由乳酸菌發酵而製造含有序列編號5或6(尤其是序列編號1~4或16)所示之胺基酸序列或包含該胺基酸序列之胜肽之方法。其中，於本發明中所製造之胜肽只要具有目標作用、例如腦功能改善作用，則亦可為包含序列編號5或6所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加有1個或數個、較佳為1~3個、更佳為1個或2個胺基酸之胺基酸序列之胜肽。又，亦可為胜肽之鹽。於本發明中，將與序列編號5或6相關之具有腦功能改善作用或其他有用功能之胜肽總稱為「功能性胜肽」。再者，於與本發明之關聯中，胺基酸之三字母表述、一字母表述及胜肽之表示係依據本領域技術人員熟知之一般規則。
    再者，作為功能之一的腦功能改善作用可利用例如使用Y字型迷宮之依據阿茲海默氏病治療藥物之評價體系之體系而確認。具體而言，可將藉由對大鼠或小鼠使用莨菪胺之類的毒蕈鹼受體拮抗劑而引起膽鹼功能性神經之功能降低、引起腦功能障礙而誘發健忘症之藥劑與被試驗胜肽同時投予，或先投予此種藥劑再投予被試驗胜肽，於使用Y字型迷宮之試驗中，以向不同臂之自發性交替行動變化率或於迷宮中之總進入次數作為指標而確認被試驗胜肽之健忘預防作用。或者，腦功能改善作用例如可藉由進行使用大鼠或小鼠之新奇物體識別試驗而確認。具體而言，可於投予被試驗胜肽並使用實驗箱之試驗中，進行記憶2個物體之訓練試驗後，隨時間經過待記憶消除，將2個物體內之1個物體更換為新奇者，於該情形時，若記得所更換之物體，則對新奇物體之探索時間增加，以此為指標而確認被試驗胜肽之記憶力增強作用。
    於本發明中，可藉由利用發酵乳酸菌或其處理物發酵獸乳或乳蛋白質而生成如上述般之功能性胜肽。
    於本發明中所使用之所謂乳酸菌係藉由發酵而由糖類產生乳酸之細菌，例如包括：屬於乳桿菌(Lactobacillus)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、明串珠菌(Leuconostoc)屬、乳球菌(Lactococcus)屬、小球菌(Pediococcus)屬、腸球菌(Enterococcus)屬、雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬、魏斯氏菌(Weissella)屬等之細菌。於本發明中，只要乳酸菌或其處理物可藉由發酵而生成功能性胜肽，則可使用該技術領域公知之乳酸菌株。再者，只要為可生成上述功能性胜肽中之至少1種之乳酸菌即可，無需為生成全部功能性胜肽者。
    作為乳酸菌之更具體之物種，作為屬於乳桿菌屬之細菌有：瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、嗜澱粉乳桿菌、加氏乳桿菌、副乾酪乳桿菌、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、洛德乳桿菌、捲曲乳桿菌、雞源乳桿菌、短乳桿菌、發酵乳桿菌、胚芽乳桿菌、及約氏乳桿菌等。
    又，作為乳酸菌之具體之其他物種，作為屬於鏈球菌屬之細菌，可列舉嗜熱鏈球菌。作為屬於雙歧桿菌屬之細菌，可列舉：短型雙歧桿菌、龍根雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、雷特氏雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、假鏈狀雙歧桿菌、及大雙歧桿菌。作為屬於腸球菌屬之細菌，可列舉：糞腸球菌、海氏腸球菌、及屎腸球菌。作為屬於明串珠菌屬之細菌，可列舉：腸膜狀明串珠菌、及乳明串珠菌。作為屬於乳球菌屬之細菌，可列舉：雷特氏乳球菌、植物乳球菌、及棉子糖乳球菌。作為屬於小球菌屬之細菌，可列舉：戊糖小球菌、及有害小球菌。作為屬於魏斯氏菌屬之細菌，可列舉：食竇魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、耐鹽魏斯氏菌、希臘魏斯氏菌、坎德勒氏魏斯氏菌、泡菜魏斯氏菌、韓國魏斯氏菌(Weissella Koreensi)、稍小魏斯氏菌、對腸膜狀魏斯氏菌、Weissella Soli、Weissella Thailandensis及綠色魏斯氏菌。
    所使用之乳酸菌或其處理物是否具有生成功能性胜肽之能力，可藉由該技術領域所公知之方法，以例如下述實施例中所記載般進行判斷。若簡單地說明，則可先以乳蛋白質(例如獸乳)作為受質於25~42℃、較佳為28~37℃下使乳酸菌或其處理物發酵5~50小時，並測定於所獲得之乳蛋白質發酵乳中所含有之功能性胜肽之量，藉此進行判斷。
    因此，於本發明中，只要為藉由如上述方法而評價為乳酸菌或其處理物具有功能性胜肽之生成能力之乳酸菌，則可使用任意之乳酸菌。作為較佳之乳酸菌，可列舉瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)。該乳酸菌係於下述實施例中確認到功能性胜肽之生成能力者，可大量生成複數種功能性胜肽而為較佳之菌株。再者，瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)係由本申請人於1997年8月15日寄存於作為基於用以寄存專利微生物之基於布達佩斯條約之國際寄存當局的獨立行政法人 製品評價技術基盤機構 專利生物寄存中心(〒305-8566日本茨城縣築波市東1丁目1番地1 築波中心中央第6)，可自該中心獲得。進而，於下述實施例中，確認數種乳酸菌(乳桿菌屬、鏈球菌屬)具有功能性胜肽之生成能力作為參考，並不限定於上述菌株。
    又，於本發明中，上述具體菌株之變異株只要具有功能性胜肽之生成能力即可使用。例如，瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)之變異株具有功能性胜肽之生成能力之可能性較高，而亦可於本發明中使用此種變異株。
    於本發明中，所謂「變異株」係指自母株獲得之任意之株。具體而言，係指利用藉由自然突變、或者由化學性或物理性之突變原引起之誘發變異來提高人工突變之頻率之方法、或特異性突變誘發技術(例如基因重組)自母株所獲得之株。藉由反覆對利用此種方法產生之微生物個體進行篩選、分離而培育出有用之微生物個體，可獲得具有目標性質之變異株。
    例如源自瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)之變異株，藉由利用聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)法之乳酸菌基因組DNA之擴增片段之分子量分佈，可容易地與其他乳酸菌株區分識別。若簡單地說明，則針對目標乳酸菌製備DNA試樣，並藉由使用具有特徵性序列(例如16S rDNA鹼基序列)之引子之PCR法進行基因擴增，對所獲得之片段之電泳圖案進行分析，藉此可判斷是否為源自瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)之變異株。其中，確認是否為變異株之方法並不限定於該方法，可藉由菌學性質等該技術領域公知之方法確認是否為變異株。例如作為以瑞士乳桿菌CM4株作為母株而獲得之變異株，已知有瑞士乳桿菌CP3232株(FERM BP-11271)，可依據本發明而使用。再者，瑞士乳桿菌CP3232株係本申請人於2010年8月4日以FERM BP-11271寄存於作為用以寄存專利微生物之基於布達佩斯條約之國際寄存當局的獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利生物寄存中心(日本茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6)。
    藉由判斷此種變異株或其處理物是否具有功能性胜肽之生成能力，可獲得能夠於本發明中使用之菌株。
    乳酸菌可藉由使用通常用於培養乳酸菌之培養基，於適當條件下進行培養而製備。用於培養之培養基只要為含有碳源、氮源、無機鹽類等，並可有效率地進行乳酸菌之培養之培養基，則亦可使用天然培養基、合成培養基中之任一者，只要為本領域技術人員，則可對於所使用之菌株適宜選擇適當之公知培養基。作為碳源，可使用乳糖、葡萄糖、半乳糖、赤糖蜜等；作為氮源，可使用酪蛋白之水解物、乳清蛋白質水解物、大豆蛋白質水解物等有機含氮化合物。又，作為無機鹽類，可使用：磷酸鹽、鈉、鉀、鎂等。作為適於乳酸菌培養之培養基，例如可列舉：MRS液體培養基、GAM培養基、BL培養基、Briggs肝肉湯、獸乳、脫脂乳、乳性乳清等。較佳為使用經殺菌之含有脫脂乳粉之乳培養基。
    又，乳酸菌之培養係於20℃至50℃、較佳為25℃至42℃、更佳為28℃至37℃下，於厭氧條件下進行。溫度條件可藉由恆溫槽、加熱套、套管等進行調整。又，所謂厭氧條件下係指乳酸菌可成長程度之低氧環境下，例如可藉由使用厭氧腔室、厭氧箱或裝有去氧劑之密閉容器或袋等，或者藉由僅密閉培養容器而設為厭氧條件。培養之形式為靜置培養、振動培養、槽培養等。又，培養時間可設為3小時至96小時。培養開始時之培養基之pH值較佳為維持在4.0~8.0。
    以下，簡單地說明乳酸菌之具體之製備例。例如於使用瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)之情形時，於經殺菌之乳培養基(含有9.0%(w/w)還原脫脂乳粉之乳培養基等)中以約3~5%之比例接種乳酸菌，於28~37℃下培養一晚(約18~28小時)。較佳為反覆進行該培養操作。
    培養後，可直接於發酵中使用所獲得之培養物，進而視需要亦可進行利用離心分離等之粗精製及/或利用過濾等之固液分離或殺菌操作。
    又，只要具有目標性質，則可使用對乳酸菌進行處理而獲得之乳酸菌之處理物，又，亦可對乳酸菌之處理物進行進一步處理。以下記載此種處理之例。
    藉由使用乳酸菌之菌體及/或處理物而發酵生乳、脫脂乳或豆乳，可製備發酵乳。例如將乳酸菌或進行其他處理之乳酸菌接種至生乳、脫脂乳或豆乳等中，於該技術領域公知之乳酸菌發酵條件(與上述乳酸菌培養之條件大致相同)下進行發酵。可直接使用所獲得之發酵乳，亦可進行過濾、殺菌、稀釋、濃縮等其他處理。
    藉由將乳酸菌之菌體及/或處理物懸浮於適當溶劑中或利用適當溶劑進行稀釋，可製備為懸浮物或稀釋物。作為可使用之溶劑，例如可列舉：水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline，PBS)等。
    藉由對乳酸菌之菌體及/或處理物進行殺菌處理，可製備為殺菌處理物。對乳酸菌之菌體及/或處理物進行殺菌處理時，例如可進行過濾殺菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加壓式殺菌等公知之殺菌處理。
    又，藉由對乳酸菌之菌體及/或處理物進行加熱處理，可製備為加熱處理物。製備加熱處理物時，係於一定時間、例如約10分鐘~1小時(例如約10~20分鐘)內對乳酸菌之菌體及/或處理物進行高溫處理(例如80~150℃)。
    藉由粉碎、細碎或磨碎乳酸菌之菌體及/或處理物，可製備粉碎物、無細胞萃取物。例如此種粉碎可藉由物理粉碎(攪拌、過濾器過濾等)、酵素溶解處理、藥品處理或自溶解處理等而進行。
    可藉由使用適當之水性溶劑或有機溶劑萃取乳酸菌之菌體及/或處理物，而獲得萃取物。作為萃取方法，只要為使用水性溶劑或有機溶劑作為萃取溶劑之萃取方法，則無特別限制，可列舉：將上述乳酸菌或對乳酸菌進行其他處理之處理物於水性或有機溶劑(例如水、甲醇、乙醇等)中浸漬、攪拌或回流之方法等公知方法。
    又，可乾燥乳酸菌之菌體及/或處理物而製成粉狀物(粉末)或粒狀物。作為具體之乾燥方法，並無特別限制，例如可列舉：噴霧乾燥、轉鼓乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥等，該等可單獨採用或可組合採用。此時，視需要亦可添加通常使用之賦形劑。
    再者，本發明中使用之乳酸菌可為濕潤菌體亦可為乾燥菌體。
    上述處理可進行單一處理亦可適宜組合進行複數種。於本發明中，亦可與乳酸菌同樣地使用此種處理物。
    上述所獲得之乳酸菌及/或處理物可單獨或與其他成分一同用作用以自獸乳或乳蛋白質中生成功能性胜肽之組合物。即，本發明提供一種含有至少1種乳酸菌或其處理物之用以生成功能性胜肽之組合物。本發明之組合物為可藉由使獸乳或乳蛋白質發酵而生成功能性胜肽者。本發明之組合物為含有上述乳酸菌及/或處理物作為有效成分者，可含有1種乳酸菌及/或處理物亦可組合含有複數種不同之乳酸菌及/或處理物，進而亦可組合含有進行不同處理之複數種乳酸菌處理物。再者，較佳為於本發明之組合物中含有乳酸菌之菌體1×107個/ml以上。
    又，於本發明之組合物中，除有效成分之乳酸菌以外，只要不阻礙目標作用，則亦可單獨添加或組合複數種添加該技術領域公知之添加劑及賦形劑。又，本發明之組合物亦可含有如促進乳酸菌發酵之添加物(例如麩醯胺酸或葡萄糖等糖)。本發明組合物之形態並無特別限制，可製成懸浮液、顆粒、粉末、膠囊等。於本發明組合物中之有效成分(乳酸菌)之含量根據其形態而有所不同，以乳酸菌之量計，通常為0.0001~99質量%，較佳為0.001~80質量%，更佳為0.001~75質量%之範圍。又，於本發明之組合物中所含有之乳酸菌約為107個/g~約1012個/g。
    藉由使用上述乳酸菌或其處理物而發酵獸乳或乳蛋白質，可獲得以高濃度含有功能性胜肽之發酵乳(發酵乳組合物)。又，使用上述乳酸菌或其處理物而發酵獸乳或乳蛋白質，可自該發酵乳中單離出功能性胜肽。
    發酵可藉由於獸乳或乳蛋白質中添加至少1種乳酸菌或其處理物，並於適當條件下進行培養而實施。作為獸乳，可使用：牛乳、山羊乳、馬乳等源自哺乳動物之乳汁；或該等之脫脂乳、還原乳、煉乳等加工乳，可使用1種乳汁亦可組合使用複數種乳汁或加工乳。乳之固形物成分濃度並無特別限定，例如於使用脫脂乳之情形時之無脂乳固形物成分濃度為3~15質量%左右，較佳為6~15質量%。獸乳亦可於發酵前進行殺菌處理。於獸乳中亦可添加如促進乳酸菌發酵之添加物(例如麩醯胺酸或葡萄糖等糖)。或者亦可自獸乳中單離乳蛋白質成分，並以此種乳蛋白質成分作為受質進行發酵。於乳蛋白質成分中，例如含有酪蛋白蛋白質。
    獸乳中所添加之乳酸菌較佳為使用經預培養之乳酸菌作為發酵劑。又，所添加之乳酸菌量並無限定，通常以乾燥乳酸菌體換算計為0.005~10質量%，較佳為0.05~5質量%。所使用之乳酸菌可直接為乳酸菌培養物亦可為其處理物。即，可為藉由過濾或離心分離所培養之乳酸菌而自培養基分離者，亦可為自培養基分離後進行冷凍或冷凍乾燥而保存者。
    發酵之條件與上述乳酸菌之培養條件大致相同，於20℃至50℃、較佳為25℃至42℃、更佳為28℃至37℃下，於厭氧條件下進行。溫度條件可藉由恆溫槽、加熱套、套管等進行調整。發酵處理可藉由靜置培養、振動培養、槽培養等形式進行。又，發酵時間可設為3~96小時，較佳為12~36小時。再者，於下述實施例中，確認到於32℃下自開始發酵起8~48小時、尤其是10~16小時大量生成功能性胜肽。又，確認到於37℃下自開始發酵起6~48小時、尤其是7~16小時大量生成功能性胜肽。因此，發酵時間較佳為於32℃下設為8~48小時，尤佳為設為10~16小時，於37℃下較佳為設為6~48小時，尤佳為設為7~16小時。又，較佳為一面測定發酵槽之pH值及酸度一面進行發酵，pH值較佳為維持在4.0~8.0。
    可以如上方式獲得發酵乳。再者，於本發明中，所謂「發酵乳(組合物)」係指全部發酵物或發酵上清液中之任一者，亦可含有發酵中所使用之乳酸菌菌體或菌體之粉碎物、受質之獸乳或乳蛋白質、或者其他成分。於所獲得之發酵乳中是否含有功能性胜肽可藉由該技術領域公知之技術方法、例如高速液相層析法、質量分析法等、或該等技術方法之組合而確認。
    於所獲得之發酵乳組合物中含有功能性胜肽，其濃度為0.1 μg/ml以上，較佳為0.5 μg/ml以上，更佳為1 μg/ml以上，進而較佳為4 μg/ml以上，尤佳為5 μg/ml~50 μg/ml或其以上。再者，於發酵乳組合物含有複數種功能性胜肽之情形時，亦可為各功能性胜肽之濃度不同者。例如，本發明之發酵乳組合物含有4 μg/ml以上包含序列編號1之胜肽、及/或含有1 μg/ml以上包含序列編號3之胜肽。藉由上述方式獲得之發酵乳組合物只要含有所需之功能性胜肽，則亦可對發酵乳進行處理，又，亦可對發酵乳之處理物進行進一步處理。以下記載此種處理之例。
    藉由將發酵乳及/或發酵乳處理物懸浮於適當之溶劑中或利用適當之溶劑進行稀釋，可製備為懸浮物或稀釋物。作為可使用之溶劑，例如可列舉：水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)等。
    藉由對發酵乳及/或發酵乳處理物進行殺菌處理，可製備為殺菌處理物。於對發酵乳及/或發酵乳處理物進行殺菌處理中，例如可進行過濾殺菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加壓式殺菌等公知殺菌處理。
    藉由對發酵乳及/或發酵乳處理物進行加熱處理，可製備為加熱處理物。於製備加熱處理物，於一定時間、例如約10分鐘~1小時(例如約10~20分鐘)內進行高溫處理(例如80~150℃)。
    又，藉由過濾或離心分離發酵乳及/或發酵乳處理物，可製備其上清液(乳清)。
    進而，乾燥發酵乳及/或發酵乳處理物，可製成粉狀物(粉末)或粒狀物。作為具體之乾燥方法，並無特別限制，例如可列舉噴霧乾燥、轉鼓乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥等，該等可單獨採用或組合採用。此時，視需要亦可添加通常使用之賦形劑。
    上述處理可進行單一處理亦可適宜組合進行複數種。於本發明中，此種發酵乳處理物亦包含於「發酵乳(組合物)」中。
    藉由上述方式所獲得之發酵乳組合物係含有至少1種功能性胜肽者，亦可組合含有複數種功能性胜肽。
    又，使用公知之分離-精製法，可自所獲得之發酵乳或其處理物精製功能性胜肽或含有其之組分。藉由單獨使用或適宜組合使用蛋白質或胜肽之單離精製中使用之通常之生物化學方法、例如硫酸銨沈澱、凝膠層析法、離子交換層析法、親和層析法等，可單離、精製功能性胜肽。進而，亦可藉由該技術領域公知之方法、例如下述製劑化方法，而以組合物之形式製備所單離之功能性胜肽。
    藉由上述方式獲得之發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物可用於利用其功能性胜肽性質之用途。例如由於包含序列編號5或6所示之胺基酸序列之胜肽具有腦功能改善作用，故而發酵乳組合物、或者功能性胜肽或其組合物可藉由改善腦功能而預防健忘，增強記憶能力。又，發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物可用於由腦功能降低引起之症狀及疾病抑鬱症、精神分裂症、譫妄症、癡呆症(腦血管性癡呆症、阿茲海默氏病等)等之治療或預防。
    又，於藉由上述方式獲得之發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物中，只要不阻礙目標作用，則亦可單獨添加或組合添加複數種下述之添加劑、具有腦功能改善作用之其他公知之成分等。因此，可藉由該技術領域公知之方法，將發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物製劑化。
    上述組合物之形態並無特別限制，例如可製成發酵後所獲得之發酵乳狀態之懸浮液形態、及藉由該技術領域公知之方法進行處理所獲得之錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑、糖漿劑、乾糖漿劑等形態。組合物較佳為製成易於經口投予或攝取之形態。再者，懸浮液等液體可為即將投予或攝取前懸浮於水或其他適當之介質中之形式，又，於為錠劑、顆粒劑之情形時亦可利用周知之方法塗佈其表面。
    上述形態之組合物可藉由於發酵所獲得之發酵乳或功能性胜肽中調配通常使用之賦形劑、崩散劑、黏合劑、濕潤劑、穩定劑、緩衝劑、潤滑劑、保存劑、界面活性劑、甜味料、矯味劑、芳香劑、酸味劑、著色劑等添加劑，依據常用方法而製造。例如於以醫藥或增進健康之目的使用發酵乳或功能性胜肽之情形時，可調配藥學上容許之載體或添加劑。作為此種藥學上容許之載體及添加物之例，可列舉：水、藥學上容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫藥添加物所容許之界面活性劑等。
    進而，組合物中亦可共存醫藥、飲食品、飼料之製造中使用之各種添加劑或其他各種物質。作為此種物質或添加劑，可列舉：各種油脂(例如大豆油、玉米油、紅花油、橄欖油等植物油；牛脂、鯡魚油等動物油脂)、天然藥(例如蜂王漿、人蔘等)、胺基酸(例如麩醯胺酸、半胱胺酸、白胺酸、精胺酸等)、多元醇(例如乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、糖醇例如山梨糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露糖醇等)、天然高分子(例如阿拉伯膠、瓊脂、水溶性玉米纖維、明膠、三仙膠、酪蛋白、麩粉或麩粉水解物、卵磷脂、澱粉、糊精等)、維生素(例如維生素C、維生素B群等)、礦物質(例如鈣、鎂、鋅、鐵等)、食物纖維(例如甘露聚醣、果膠、半纖維素等)、界面活性劑(例如甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯等)、純化水、賦形劑(例如葡萄糖、玉米澱粉、乳糖、糊精等)、穩定劑、pH值調整劑、抗氧化劑、甜味料、呈味成分、酸味劑、著色料及香料等。
    又，組合物中可調配例如下述成分作為上述有效成分以外之功能性成分、醫藥成分或添加劑：食品成分：銀杏葉萃取物、花生四烯酸(Arachidonic Acid，ARA)、γ-胺基丁酸(γ-aminobenzoic acid，GABA)、茶胺酸、腦醯胺、咖啡因、肉鹼、α-甘油磷醯膽鹼(α-GPC(GlyceroPhosphoryl Choline))、假馬齒莧、DHA(Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸)結合磷脂質、磷脂醯絲胺酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂醯膽鹼、聖約翰草、蝦紅素、菸鹼酸、吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)、輔酶Q10(CoQ(Coenzyme Q)10)、不飽和脂肪酸(二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EicosaPentaenoic acid，EPA)等)、多酚類(白藜蘆醇、漂木酸、兒茶酸等)；醫藥品：癡呆症治療藥物：乙醯膽鹼酯酶抑制劑(多奈哌齊、加蘭他敏、利伐斯的明、他克林等)、NMDA(N-methyl-D-aspartic acid，N-甲基-D-天冬醯胺酸)受體拮抗劑(美金剛胺(memantine)等)；抗焦慮藥：苯二氮呯系抗焦慮藥；抗抑鬱藥：選擇性血清素再吸收抑制劑(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSRI)、血清素-去甲腎上腺素(去甲腎上腺素)再吸收抑制劑(Serotonin-Norepinephrine Reuptake Inhibitors，SNRI)、三環系抗抑鬱藥(Tricyclic Antidepressant，TCA)、四環系抗抑鬱藥、三唑并吡啶系抗抑鬱藥Serotonin Antagonist and Reuptake Inhibitors，SARI)、單胺氧化酶抑制劑(MAO(Monoamine Oxidase)抑制劑)、去甲腎上腺素功能性-特異的血清素功能性抗抑鬱藥(Noradrenergic and Specific Serotonergic Antidepressants，NaSSA)、去甲腎上腺素-多巴胺再吸收抑制劑(Norepinephrine-Dopamine Reuptake Inhibitor，NDRI)等；抗精神病藥；安眠藥。
    該等功能性成分、醫藥成分或添加劑之調配量可根據其種類與所需之攝取量而適宜決定。
    再者，投予或攝取所製造之組合物之對象為脊椎動物，具體而言為哺乳動物，例如人類、靈長類(猴、黑猩猩等)、家畜動物(牛、馬、豬、羊、雞等)、寵物動物(狗、貓等)、實驗動物(小鼠、大鼠等)，進而爬蟲類及鳥類。尤佳為以需求功能性胜肽之攝取之對象、例如需要治療由腦功能降低引起之症狀及疾病的人類等作為對象。組合物之投予或攝取量根據對象之年齡及體重、投予-攝取路徑、投予-攝取次數、投予目的等而不同，可根據本領域技術人員之酌情處理而以可達成目標作用之方式在較廣範圍內進行變更。組合物中所含有之功能性胜肽之含有比例並無特別限定，只要配合易製造性或較佳之一日投予量等而適宜調節即可。每1日之攝取量可以1次攝取，亦可分數次攝取。又，其投予或攝取之頻率亦無特別限定，可根據投予-攝取路徑、對象之年齡及體重、目標效果之各種條件而適宜選擇。組合物之投予-攝取路徑並無特別限定，較佳為經口投予或經口攝取。例如亦可調配至飲食品或飼料中或者製成錠劑或顆粒劑等進行經口投予或攝取。
    又，所製造之組合物亦可與其他醫藥、治療或預防法等併用。此種其他醫藥可與組合物一併製成一種製劑，又，亦可為各別製劑而同時或空出間隔投予。
    又，由於藉由本發明所製造之發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物之安全性較高且易長期連續攝取，故而亦可用於飲食品及飼料中。藉由將發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物添加或調配至各種飲食品中而連續地攝取，可期待各種效果。
    因此，於本發明中，藉由將以上述方式製造之發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物調配至飲食品中而製造功能性飲食品。於本發明中，飲食品亦包括飲料及補充品。於本發明之飲食品中，除藉由功能性胜肽而實現增進健康之健康飲食品、功能性飲食品、特定保健用飲食品、補充品(營養輔助食品、健康輔助食品、營養輔助劑)等以外，亦包括全部飲食品。
    作為飲食品之具體例，可列舉：經管經腸營養劑等流質食物；模壓點心、錠劑、咀嚼片、粉劑、散劑、膠囊劑、顆粒劑及飲料劑等製劑形態之健康飲食品及營養輔助飲食品；綠茶、烏龍茶及紅茶等茶飲料、清涼飲料、果凍飲料、運動飲料、乳飲料、碳酸飲料、蔬菜飲料、果汁飲料、發酵蔬菜飲料、發酵果汁飲料、發酵乳飲料、發酵乳(飲料酸乳酪、固體酸乳酪)、發酵乳飲料(殺菌)、乳酸菌飲料、濃縮型飲料、濃縮固形物、乳飲料(咖啡牛乳等)、粉末飲料、可可飲料、牛乳及純化水等飲料；奶油、果醬、蔬菜末及人造奶油等西點塗料類；蛋黃醬、起酥油、乳蛋糕乳脂、色拉醬類、麵包類、米飯類、面類、麵食、醬湯、豆腐、酸乳酪、湯或醬料類、糕點(例如餅乾或曲奇類、巧克力、糖果、蛋糕、冰激淩、口香糖、錠劑)等。
    於本發明中，飲食品可調配發酵乳組合物或功能性胜肽，以及該飲食品之製造中所使用之其他食品原材料、各種營養素、各種維生素、礦物質、食物纖維、各種添加劑(例如呈味成分、甜味料、有機酸等酸味劑、穩定劑、香料)等，並依據常用方法而製造。關於飲食品中之發酵乳或功能性胜肽之調配量，本領域技術人員可考慮到飲食品之形態或所要求之食味或食感而適宜決定。
    飲食品可藉由本領域技術人員能夠利用之任意適當之方法製造。例如，可將發酵乳或功能性胜肽製備為液體狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀或顆粒狀後，將其調配於飲食品中。或者亦可於飲食品之原料中直接混合或溶解發酵乳或功能性胜肽。發酵乳或功能性胜肽亦可塗佈、包覆、滲透或噴附於飲食品上。發酵乳或功能性胜肽可均勻地分散於飲食品中，亦可分佈不均。亦可製成加入有發酵乳或功能性胜肽之膠囊等。亦可利用可食用膜或食用塗佈劑等包覆發酵乳或功能性胜肽。又，亦可於發酵乳或功能性胜肽中添加適當之賦形劑等後成形為錠劑等形狀。亦可對飲食品進行進一步加工，此種加工品之製造方法亦包含於本發明之範圍內。
    於本發明飲食品之製造方法中，亦可使用飲食品中慣用之各種添加物。作為添加物並無限定，可列舉：顯色劑(亞硝酸鈉等)、著色料(梔子色素、紅102等)、香料(甜橙香料等)、甜味料(甜菊、阿斯巴甜等)、防腐劑(乙酸鈉、山梨酸等)、乳化劑(軟骨素硫酸鈉、丙二醇脂肪酸酯等)、抗氧化劑(EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)二鈉、維生素C等)、pH值調整劑(檸檬酸等)、化學調味料(肌苷酸鈉等)、增黏劑(三仙膠等)、膨脹劑(碳酸鈣等)、消泡劑(磷酸鈣等)、黏合劑(聚磷酸鈉等)、營養強化劑(鈣強化劑、維生素A等)、賦形劑(水溶性糊精等)等。進而，亦可進一步添加亞洲蔘萃取物、刺五加萃取物、桉樹萃取物、杜仲茶萃取物等功能性原材料。
    藉由上述方式製造之飲食品具有由起因於功能性胜肽之各種功能，並且安全性較高而無副作用之擔憂。
    進而，發酵乳組合物或功能性胜肽或其組合物不僅可調配至人類用之飲食品中，亦可調配至家畜(牛、豬等)、賽馬、寵物(狗、貓等)之動物飼料中。飼料除了對象為人類以外與飲食品大致相同，因此與上述飲食品有關之記載亦同樣適用於飼料。
    進而，亦可以藉由本發明之製造方法所製造之胜肽作為基礎，使用該技術領域公知之方法而進一步缺失、置換或附加1個或數個胺基酸，而製造具有序列編號5或6所示之胺基酸序列之胜肽。 [實施例]
    以下，藉由實施例及圖式更具體地說明本發明。但是，下述實施例並不限定本發明。 [實施例1]
    於本實施例中，使用乳酸菌而製備發酵乳。使用於105℃下對9.0%(w/w)還原脫脂乳粉高壓蒸氧滅菌處理10分鐘進行殺菌者作為乳培養基。其後，於所製備之乳培養基中以3%之比例接種含有乳酸菌之發酵乳，使用於37℃下培養24小時所獲得之發酵乳作為發酵劑。本培養係於乳培養基中添加3%之發酵劑，並於37℃下進行24小時發酵。針對發酵之進行較差之試樣，延長發酵時間，設為48~72小時。
    使用瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)CM4株(寄存編號FERM BP-6060)作為發酵劑，又，亦對瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)JCM1120株、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)JCM1004株、保加利亞德式乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)JCM1002株、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)JCM1132株、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)JCM1134株、及嗜熱乳桿菌(Streptococcus thermophilus)JCM20026株進行評價以供參考。 [實施例2]
    於本實施例中，測定發酵乳上清液中之胜肽(序列編號1~4)之含量。具體而言，於實施例1所獲得之發酵乳100 μl中添加超純水600 μl、乙腈200 μl、10%三氯乙酸水溶液100 μl並充分地混合。繼而，以15,000 rpm離心10分鐘並回收上清液，繼而將所獲得之溶液利用20%乙腈水溶液稀釋至初始濃度之50倍，並利用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)定量分析各胜肽。使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液，藉由梯度分析而分離各成分，定量係以合成胜肽作為標準物質製作校準曲線而算出含量。
    將各發酵乳上清液中之各胜肽(序列編號1~4)之定量結果示於表1。
    由表1之結果顯示：藉由乳酸菌發酵而生成有胜肽(序列編號1~4)。又，發現尤其是藉由使用瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)及保加利亞德式乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)，而大量產生該等胜肽。進而，得知於發酵乳中之胜肽濃度為0.1 μg/ml~約50 μg/ml。 [實施例3]
    於本實施例中，對發酵乳上清液中之胜肽(序列編號1~4)於發酵中之隨時間經過之變化進行研究。具體而言，利用於105℃下對9.0%(w/w)還原脫脂乳粉高壓蒸氣滅菌處理10分鐘進行殺菌者作為乳培養基。其後，於所製備之乳培養基中以3%之比例接種含有瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)CM4株(寄存編號FERM BP-6060)之發酵乳，並於37℃下培養24小時，使用所獲得之發酵乳作為發酵劑。本培養係於乳培養基中添加3%之發酵劑並於32℃或37℃下進行發酵，隨時間經過於1、2、4、8、12、16、24、48小時進行回收。其後，進行與實施例2相同之預處理，使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)定量分析各胜肽(序列編號1、3、4)。以與實施例2相同之方式，使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液，藉由梯度分析而分離各成分，定量係以合成胜肽作為標準物質製作校準曲線而算出含量。
    又，針對瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)發酵乳中所產生之作為生理活性胜肽所公知之具有降血壓作用之雞胜肽(Val-Pro-Pro及Ile-Pro-Pro)亦同樣地定量分析以供比較。
    將各上清液中之胜肽之定量結果示於表2及圖1。

    由上述結果得知：自培養開始起3~96小時生成該等胜肽。具體而言，於32℃下自開始發酵起8~48小時、尤其是於10~16小時大量生成功能性胜肽，又，於37℃下自開始發酵起6~48小時、尤其是於7~16小時大量生成功能性胜肽。即，得知可以較先前已知之生理活性胜肽相對短時間之發酵(8~12小時左右)而更高地產出。進而，於發酵乳中之胜肽濃度自開始培養起2小時為0.5 μg/ml以上，自開始培養起8小時(32℃)或6小時(37℃)為1 μg/ml以上或視情況為5 μg/ml以上。 [實施例4]
    於本實施例中，顯示出Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-75)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)0.05 nmol/kg體重(0.1 μg/kg體重)、0.5 nmol/kg體重(1 μg/kg體重)、1.5 nmol/kg體重(3 μg/kg體重)、5 nmol/kg體重(10 μg/kg體重)、50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)作為被試驗物質。被試驗物質係於實施評價自發性交替行動之Y字迷宮試驗60分鐘前對小鼠單次經口投予。又，於實施Y字迷宮試驗30分鐘前，為了對小鼠誘發腦功能障礙(記憶障礙及/或癡呆障礙)，以成為1 mg/kg體重之方式於背部皮下投予莨菪胺。於Y字迷宮試驗中，使用一根臂之長度為40 cm、壁高度為12 cm、地板寬度為3 cm、上部寬度為10 cm且以120度之角度分別連接3根臂之Y字迷宮作為實驗裝置。將小鼠置於Y字迷宮之任一臂之前端，於8分鐘內使之自由探索迷宮內，並依序記錄小鼠所移動之臂。對小鼠於測定時間內移動至各臂之次數進行計數，將其設為總進入數，並研究其中連續選擇不同之三個臂之組合(例如，於將3根臂分別設為A、B、C時，於所進入之臂之順序為ABCBACACB之情形時，包括重複在內而計數為4)，將該數設為自發性交替行動數。將用自發性交替行動數除以自總進入數減2之數並乘以100所求出之值設為自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。本指標之值越高，表示越可保持短期記憶。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與胜肽投予群之顯著差異檢驗係於單向配置分散分析後利用Dunnett(Dunnett)型多重比較檢驗而進行。
    將結果示於圖2。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號1)於0.05 nmol/kg體重~500 nmol/kg體重(0.1 μg/kg體重~1000 μg/kg體重)之範圍內具有健忘預防作用。 [實施例5]
    於本實施例中，顯示出Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)相關胜肽之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-45)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、或Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)50 nmol/kg體重(120 μg/kg體重)、或Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(IPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號7)50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、或Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro(NIPPLTQTPVVVPPFLQP：序列編號8)50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、或Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe(TQTPVVVPPF：序列編號9)50 nmol/kg體重(50 μg/kg體重)作為被試驗物質。以與實施例4相同之方式求出自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與各胜肽投予群之顯著差異檢驗係於單向配置分散分析後利用Dunnett(Dunnett)型多重比較檢驗而進行。
    將結果示於圖3。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號1)於50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM(序列編號2)於50 nmol/kg體重(120 μg/kg體重)、IPPLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號7)於50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)具有健忘預防作用。針對NIPPLTQTPVVVPPFLQP(序列編號8)於50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)及TQTPVVVPPF(序列編號9)於50 nmol/kg體重(50 μg/kg體重)(未顯示資料)，與莨菪胺對照群進行比較，未見顯著差異。 [實施例6]
    於本實施例中，顯示出Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)相關胜肽之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=14-15)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)、或Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(PPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號10)500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)作為被試驗物質。以與實施例4相同之方式求出自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與各胜肽投予群之顯著差異檢驗係於單向配置分散分析後利用Dunnett(Dunnett)型多重比較檢驗而進行。
    將結果示於圖4。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號1)於500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)、PPLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號10)於500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)具有健忘預防作用。 [實施例7]
    於本實施例中，顯示出Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)之記憶力增強作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=14-15)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)作為被試驗物質。被試驗物質係於實施評價記憶保持之新奇物體識別試驗60分前對小鼠單次經口投予。於新奇物體識別試驗中，使用30×30×30 cm之箱作為實驗裝置。作為馴化操作，於鋪設墊料之實驗裝置內放入小鼠5分鐘使之自由探索裝置。於馴化操作之次日實施訓練試驗。訓練試驗中，於3種物體中選擇2個設置於實驗裝置內(物體沿地板之中心線分別位於自兩側之壁起8 cm之位置，將其位置設為X1及X2)。再者，針對所設置之物體之選擇，以動物及群組間無偏差之方式預先無規地選擇。於經口投予被試驗物質或水60分鐘後，將小鼠放入實驗裝置中5分鐘，並測定小鼠對各物體接近、探索1 cm以內之時間(秒)。於訓練試驗之48小時後實施保持試驗。保持試驗中，以與訓練試驗相同之方式於實驗裝置內設置2個物體，將其中1個更換為與訓練試驗所使用者不同之物體(新奇物體)，將其位置設為Y(作為例，於訓練試驗中將物體A設置於X1、將物體B設置於X2之情形時，於保持試驗中代替物體A設置物體C作為新奇物體，將其位置設為Y)。針對訓練試驗及保持試驗，測定小鼠對各物體接近、探索1 cm以內之時間(秒)(其中，去除在物體上之狀態)。針對訓練試驗及保持試驗，分別求出對2個物體進行探索之時間之比率。對各物體之探索時間之比率(%)，各群均以平均值±標準誤差表示。顯著差異檢驗係針對於保持試驗中對新奇物體(設置於Y上之物體)之探索時間之比率、與訓練試驗中對設置於放置有新奇物體之位置之物體(設置於X1或X2處之物體)之探索時間之比率，於對照群與胜肽群之間利用學生(Student)t檢驗而進行。
    將結果示於圖5。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號1)於500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)具有記憶力增強作用。 [實施例8]
    於本實施例中，顯示出Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)相關胜肽之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=27-40)使之自由攝取食餌及水。使用Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(TQTPVVVPPFLQPE：序列編號11)50 nmol/kg體重(80 μg/kg體重)作為被試驗物質。以與實施例4相同之方式求出自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與胜肽投予群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。
    將結果示於圖6。顯示出TQTPVVVPPFLQPE(序列編號11)於50 nmol/kg體重(80 μg/kg體重)具有健忘預防作用。 [實施例9]
    於本實施例中，顯示出Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)相關胜肽之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=11-40)使之自由攝取食餌及水。使用Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(PLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號12)500 nmol/kg體重(900 μg/kg體重)、或Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(LTQTPVVVPPFLQPE：序列編號13)500 nmol/kg體重(850 μg/kg體重)、或Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(PVVVPPFLQPE：序列編號14)500 nmol/kg體重(630 μg/kg體重)、或Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(VVVPPFLQPE：序列編號15)500 nmol/kg體重(580 μg/kg體重)作為被試驗物質。以與實施例4相同之方式求出自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與各胜肽投予群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。
    將結果示於圖7。顯示出PLTQTPVVVPPFLQPE(序列編號12)於500 nmol/kg體重(900 μg/kg體重)、LTQTPVVVPPFLQPE(序列編號13)於500 nmol/kg體重(850 μg/kg體重)、PVVVPPFLQPE(序列編號14)於500 nmol/kg體重(630 μg/kg體重)、VVVPPFLQPE(序列編號15)於500 nmol/kg體重(580 μg/kg體重)具有健忘預防作用。 [實施例10]
    於本實施例中，顯示出Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-30)使之自由攝取食餌及水。使用Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號3)150 nmol/kg體重(380 μg/kg體重)、500 nmol/kg體重(1280 μg/kg體重)作為被試驗物質。以與實施例4相同之方式求出自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之間之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與胜肽投予群之顯著差異檢驗係利用學生t檢驗而進行。
    將結果示於圖8。顯示出SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(序列編號3)於150 nmol/kg體重~500 nmol/kg體重(380 μg/kg體重~1280 μg/kg體重)之範圍內具有健忘預防作用。 [實施例11]
    於本實施例中，顯示出Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu相關胜肽之健忘預防作用。
    使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-30)使之自由攝取食餌及水。使用Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號3)500 nmol/kg體重(1280 μg/kg體重)、或Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(MHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號16)500 nmol/kg體重(1140 μg/kg體重)、或Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(LQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號4)500 nmol/kg體重(1400 μg/kg體重)、或Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQ：序列編號17)500 nmol/kg體重(1150 μg/kg體重)作為被試驗物質。以與實施例4相同之方式求出自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之間之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與各胜肽投予群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。
    將結果示於圖9。顯示出SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(序列編號3)於500 nmol/kg體重(1280 μg/kg體重)、或MHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(序列編號16)於500 nmol/kg體重(1140 μg/kg體重)、或LQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(序列編號4)於500 nmol/kg體重(1400 μg/kg體重)具有健忘預防作用，但未能確認到SWMHQPHQPLPPTVMFPPQ(序列編號17)500 nmol/kg體重(1150 μg/kg體重)之顯著差異。 [產業上之可利用性]
    根據本發明，可提供一種酪蛋白衍生胜肽之製造方法。該酪蛋白衍生胜肽為主要具有腦功能改善作用者，並且可藉由本發明之製造方法簡便且有效率地製造此種功能性胜肽。又，藉由本發明，可提供一種含有該胜肽之組合物或功能性食品之製造方法。因此，本發明可用於醫藥、飲食品、增進健康等領域。 [寄存編號]
    寄存編號FERM BP-6060(瑞士乳桿菌CM4株，1997年8月15日寄存)
    寄存編號FERM BP-11271(瑞士乳桿菌CP3232株，2010年8月4日寄存) [序列表自由內容]
    序列編號5~8及10~17：人工蛋白質(功能性胜肽)
    序列編號9：人工蛋白質(合成胜肽)
    圖1係表示使用瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)CM4株之發酵乳中之胜肽量之隨時間經過之變化的圖表。
    圖2係表示序列編號1之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。#表示相對於莨菪胺對照群P<0.05，##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01。
    圖3係表示序列編號1、2、7或8之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01。
    圖4係表示序列編號1或10之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。#表示相對於莨菪胺對照群P<0.05。
    圖5係表示序列編號1之胜肽之記憶力增強效果的圖表。*表示相對於水投予對照群P<0.05。
    圖6係表示序列編號11之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。#表示相對於莨菪胺對照群P<0.05。
    圖7係表示序列編號12~15之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。#表示相對於莨菪胺對照群P<0.05，表示相對於莨菪胺對照群P<0.1。
    圖8係表示序列編號3之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01，表示相對於莨菪胺對照群P<0.1。
    圖9係表示序列編號3、4、16或17之胜肽之莨菪胺誘發健忘預防效果的圖表。**表示相對於水投予對照群P<0.01。##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01，#表示相對於莨菪胺對照群P<0.05。
    <110> 日商可爾必思股份有限公司
    <120> 利用乳酸菌發酵之酪蛋白衍生胜肽之製造方法
    <130> PH-4882TW
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    <210> 1
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    <212> PRT
    <213> 乳酸菌
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 21
    <212> PRT
    <213> 乳酸菌
    <400> 2
    <210> 3
    <211> 22
    <212> PRT
    <213> 乳酸菌
    <400> 3
    <210> 4
    <211> 24
    <212> PRT
    <213> 乳酸菌
    <400> 4
    <210> 5
    <211> 19
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (1)..(1)
    <223> Xaa=缺失、Ile或Asn-Ile
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (19)..(19)
    <223> Xaa=缺失或Val-Met
    <400> 5
    <210> 6
    <211> 21
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (1)..(1)
    <223> Xaa=缺失、Ser-Trp或Leu-Gln-Ser-Trp
    <400> 6
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    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <400> 7
    <210> 8
    <211> 18
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <400> 8
    <210> 9
    <211> 10
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 合成胜肽
    <400> 9
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    <211> 17
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <400> 10
    <210> 11
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    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <400> 11
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    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <400> 12
    <210> 13
    <211> 15
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 功能性胜肽
    <400> 13
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    <211> 11
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    <213> 人工
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    <223> 功能性胜肽
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    <212> PRT
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    <223> 功能性胜肽
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    <211> 20
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    <223> 功能性胜肽
    <400> 16
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    <223> 功能性胜肽
    <400> 17
    权利要求:
    Claims (14)
    [1] 一種胜肽之製造方法，其特徵在於：其係包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽之製造方法，並且使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並自所獲得之發酵乳採集該胜肽。
    [2] 如請求項1之方法，其中乳酸菌係屬於選自由乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、小球菌屬、及魏斯氏菌屬所組成之群中之屬之至少1種細菌。
    [3] 如請求項1或2之方法，其中乳酸菌係選自由瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、嗜澱粉乳桿菌、加氏乳桿菌、副乾酪乳桿菌、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、洛德乳桿菌、捲曲乳桿菌、雞源乳桿菌、短乳桿菌、發酵乳桿菌、胚芽乳桿菌、及約氏乳桿菌所組成之群中之至少1種。
    [4] 如請求項1或2之方法，其中乳酸菌為嗜熱鏈球菌。
    [5] 如請求項1或2之方法，其中乳酸菌為瑞士乳桿菌CM4株(寄存編號FERM BP-6060)。
    [6] 如請求項1至5中任一項之方法，其係自開始發酵起3~96小時後採集胜肽。
    [7] 一種含有包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽的組合物之製造方法，其特徵在於：其係使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並將所獲得之發酵乳或自其所採集之包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽製劑化。
    [8] 一種組合物，其特徵在於：其含有包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽。
    [9] 一種發酵乳組合物，其特徵在於：其係使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵而獲得，並且含有包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽。
    [10] 如請求項9之組合物，其含有0.1 μg/ml以上之上述胜肽。
    [11] 一種飲食品，其調配有如請求項8至10中任一項之組合物。
    [12] 一種補充品，其調配有如請求項8至10中任一項之組合物。
    [13] 一種功能性飲食品之製造方法，其特徵在於：其係使用至少1種乳酸菌及/或其處理物使獸乳或乳蛋白質發酵，並將所獲得之發酵乳或自其所採集之包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽調配於飲食品中。
    [14] 一種乳酸菌或其處理物之用途，其係為了生成包含序列編號1~4或16中之任一者所示之胺基酸序列之胜肽而使用至少1種。
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    同族专利:
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    JP2013005757A|2013-01-10|
    引用文献:
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2011140737A|JP5686680B2|2011-06-24|2011-06-24|乳酸菌発酵によるカゼイン由来ペプチドの製造方法|
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